Характеристика и механизм действия экзосом в косметологии

Алена Дагар, кандидат медицинских наук, врач-дерматолог, косметолог, главный врач клиники
«Дом красоты Ювента» (Саранск) и клиники «Аэстетика»

Впервые экзосомы наблюдали в 1946 году E. Chargaff и R. West в качестве прокоагулянтных тромбоцитарных частиц. В дальнейшем в 1967 году их обнаружил P. Wolf и назвал «тромбоцитарная пыль», а в 1969-м в ходе исследования костной кальцификации их выявил Н.С. Anderson [1].
Как внеклеточные микровезикулы экзосомы были впервые описаны только в середине 1980‑х годов научной группой R.M. Johnstone, которая выявила, что в период созревания ретикулоцитов млекопитающих рецептор трансферрина и некоторые другие мембрано-ассоциированные элементы избирательно секретируются клеткой во внеклеточных пузырьках, разносимых кровотоком по всему организму, которые впоследствии были названы экзосомами. В 2007 году Н. Valadi с соавторами обнаружил, что экзосомы могут переносить нуклеиновые кислоты, в частности РНК.
С этого момента экзосомальный транспорт начал активно изучаться, и уже в 2013 году Нобелевскую премию по физиологии или медицине вручили ученым из США Джеймсу Ротману, Рэнди Шекману и Томасу Зюдхофу из Германии – «за открытие системы везикулярного транспорта – основной транспортной системы в наших клетках» [1].
Экзосомы – микроскопические внеклеточные везикулы (пузырьки) диаметром 30–120 наномет­ров, выделяемые в межклеточное пространство клетками органов и тканей. Экзосомы обнаружены в различных тканевых жидкостях организма, таких как сыворотка крови, спинномозговая жидкость, а также в моче, слюне и грудном молоке. Показано, что экзосомы содержат порядка 4000 различных белков, более 1500 разных микроРНК и мРНК, а также ДНК [2].
Образованию экзосом предшествует впячивание микродоменов плазматической мембраны, покрытых клатрином. Затем эндосомальный комплекс сортировки (англ. ESCRT) обеспечивает превращение впячиваний мембраны в ранние эндосомы, которые транспортируют убиквитинилированные продукты. Далее происходит повторное впячивание в ранние эндосомы, при этом образуются интралюминальные пузырьки (англ. ILVs), которые накап­ливаются и созревают внутри эндосом – мультивезикулярных телец (рис. 1). Мультивезикулярные тельца либо превращаются в лизосомы, где происходит деградация их содержимого, либо сливаются с плазматической мембраной (в таком случае их называют экзоцитарными мультивезикулярными тельцами), при этом интралюминальные пузырьки – экзосомы – высвобождаются во внеклеточное пространство [2, 3].

Белковый состав экзосом

Экзосомы содержат два типа белка. Первая группа – это общие белки, включающие семейство тетраспанинов (CD9, CD63, CD81), белки цитоскелета (актин, тубулин), белки теплового шока (HSP70, HSP90); наличие экзосом можно подтвердить путем идентификации этих белков. Другие специфические белки различаются в зависимости от клетки происхождения [4].

На мембране экзосом широко представлены различные гликопротеины, в частности, лектины, С- и Р-селектины. Внутри экзосом встречаются ферменты (например, ГТФазы

семейства Rab), которые способствуют слиянию мембран; ферменты метаболизма (пероксидаза, пируваткиназа, липидкиназа и енолаза-1); белки главного комплекса гистосовместимости; аннексины (регулируют изменения мембранного цитоскелета и механизмы слияния мембран); нейромедиа-торы [5]. Кроме того, экзосомы являются переносчиками целого ряда медиа-торов, в т.ч. цитокинов. Чаще всего в экзосомах обнаруживают IL-1β, IL -1α, ФНО, IL-6 и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Также экзосомы переносят хемокины, например, IL-8 (CXCL8) и фракталкин (CX3CL) в норме и CCL2, CCL3, CCL4, CCL5 и CCL20 – при онкологической патологии [1].

Липидный состав экзосом

Мембраны экзосом обогащены сфингомиелином, холестерином и гликосфинголипидами, а соотношение сфингомиелин/фосфатидилхолин в экзосомах 3 : 1 по сравнению с клетками-донорами, в которых это соотношение примерно 1 : 2,5. Также именно к сфинголипидам относятся церамиды, которые обеспечивают секрецию экзосом материнской клеткой [1].

РНК в экзосомах

Экзосомы содержат мРНК, длинные некодирующие РНК, миРНК, рРНК, фрагменты тРНК, микроРНК. Позднее было показано, что перенос экзосомами мРНК и микроРНК к клеткам-мишеням способствует регенерации тканей после стрессовых воздействий, поддержанию гомеостаза и сохранению функционального состояния клеток [1].

ДНК в экзосомах

Известно, что в экзосомах находятся митохондриальная ДНК, одноцепочечная и двухцепочечная ДНК. В отличие от РНК, наличие ДНК в экзосомах обычно указывает на патологические состояния, такие как онкологические заболевания, генетические нарушения [1].

Источники получения экзосом

Мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека (HucMSC). Представляют собой мезенхимальные стволовые клетки, которые собираются из различных частей пуповины человека. Эти клетки обладают способностью самообновляться и дифференцироваться в несколько типов клеток, включая остеобласты, хондроциты и адипоциты. HucMSCs проявляют иммуномодулирующие, противовоспалительные и антиоксидантные свойства, что делает их перспективными кандидатами для клеточной терапии и регенеративной медицины.

Недавно исследователи изучали влияние экзосом, полученных из HucMSC, на смягчение вредных последствий воздействия ультрафиолета на кожу. В частности, исследователи сосредоточились на роли 14–3-3ζ, белка, обнаруженного в экзосомах HucMSC, и его взаимодействии с SIRT1. Исследование показало, что экзосомы HucMSC, содержащие 14–3-3ζ, могут эффективно защищать клетки кожи от индуцированного UV-повреждения, уменьшая окислительный стресс и воспаление, опосредуя путь SIRT1. Более того, эти экзосомы могут усиливать пролиферацию и миграцию кератиноцитов HaCaT, ингибируя при этом повреждение, вызванное ультрафиолетом спектра B. Результаты также показывают, что эти экзосомы могут уменьшать апоптоз и старение, увеличивать экспрессию коллагена I типа и снижать экспрессию мат-риксной металлопротеиназы (MMP1) в фотостареющих клетках кожи [3].

Стволовые клетки жировой ткани (ADSCs). Процесс развития адипоцитов из мезенхимальных клеток представляет собой многогранную серию событий, как транскрипционных, так и нетранскрипционных, которые происходят на протяжении всей жизни человека. Клетки с признаками преадипоцитов могут быть получены из жировой ткани взрослых людей и выращены in vitro. Затем эти клетки можно стимулировать к дифференцировке в адипоциты.

Роль экзосом, полученных из стволовых клеток жировой ткани (ADSC), в предотвращении фотостарения широко изучалась. Исследования показывают, что эти экзосомы эффективно ингибируют повреждение клеточной ДНК, вызванное UVВ-излучением, посредством подавления АФК. Более того, они также могут значительно предотвратить сверхэкспрессию MMP-1, MMP-3 и COL-3 и, следовательно, защитить целостность ECM. Эти экзосомы могут также регулировать Nrf2 и MAPK/AP-1 и активировать пути TGF-β/Smad выше перечисленных.

Кроме того, исследования также показали, что миР-1246, широко распространенная нуклеиновая кислота в экзосомах, полученных из ADSC, ингибирует сигнальный путь MAPK/AP-1, снижая выработку MMP-1, и активирует путь TGF-β/Smad, что приводит к усилению секреции проколлагена I типа и противовоспалительного действия. Эксперименты in vivo на мышах Куньмин продемонстрировали, что миР-1246 может защищать от фотостарения кожи, вызванного ультрафиолетом спектра B, подав-ляя образование морщин, утолщение эпидермиса и потерю коллагеновых волокон. В совокупности эти данные позволяют предположить, что экзосомы, полученные из ADSC, особенно миР-1246, играют жизненно важную роль в лечении фотостарения, регулируя различные сигнальные пути [3].

Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (BM-MSC). Представляют собой тип взрослых стволовых клеток, которые об ладают большим терапевтическим потенциалом в регенеративной медицине. Экзосомы, секретируемые BM-MSC, оказались важнейшим компонентом их паракринных сигнальных механизмов. Экзосомы, полученные из BM-MSC, содержат множество биоактивных молекул, таких как факторы роста, цитокины и микроРНК, которые могут способствовать восстановлению и регенерации тканей в различных моделях повреждений и заболеваний.

Показано, что BM-MSC могут дозозависимым образом смягчать вызванный UV-излучением окислительный стресс и воспаление, повышать жизнеспособность клеток фибробластов дермы человека (HDF). BMSC-экзосомы также снижают экспрессию MMP-1 и MMP-3, одновременно способствуя экспрессии COL-1 путем изменения пути MAPK/AP-1. Более того, миР-29b-3p, обнаруженная в экзосомах, полученных из BM-MSC, может участвовать в реверсии подавления миграции HDF, вызванного UVB, в усилении окислительного стресса и стимулировании апоптоза. Предполагается, что упомянутая микроРНК может нацеливаться на MMP-2 и тем самым предотвращать деградацию COL-1 [3].

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК). Представляют собой тип стволовых клеток, которые генерируются путем перепрограммирования взрослых клеток, таких как клетки кожи, в состояние, подобное эмбриональному. Клетки иПСК обладают способностью дифференцироваться практически в любой тип клеток организма и имеют значительный потенциал для регенеративной медицины и открытия новых лекарств. Впервые иПСК были успешно созданы в 2006 году путем перепрограммирования клеток кожи человека с использованием комбинации четырех факторов транскрипции, включая Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc. Это открытие стало значительным прорывом в области исследований стволовых клеток и привело к лучшему пониманию клеточного перепрограммирования и его потенциального применения в будущем.

Было замечено, что экзосомы, полученные из иПСК человека (иПСК-экзо), способствуют пролиферации и миграции HDF в нормальных условиях. При UVB-облучении HDF повреждаются и сверхэкспрессируются ферменты, разрушающие матрикс (MMP-1/3), но предварительная обработка иПСК-экзо ингибирует эти повреждения. Также иПСК-экзо увеличили экспрессию коллагена I типа в фотостарых HDF. Кроме того, иПСК-экзо значительно снижали экспрессию SA-β-Gal и MMP-1/3 и восстанавливали экспрессию стареющих HDF – COL-1. Известно, что SA-β-Gal является переключателем, который сдвигает клетки в сторону старения и известен как маркер старения. Таким образом, эти результаты позволяют предположить, что иПСК-экзо могут иметь терапевтический потенциал в лечении старения кожи [3].

Дермальные фибробласты человека (HDF). Являются основными клетками кожи, происходящими из МСК, которые играют решающую роль в ремоделировании внеклеточного матрикса (ECM) и обеспечении целостности и эластичности кожи. В процессе старения кожи снижается пролиферация HDF, выработка коллагена и увеличивается количество MMP, что влечет за собой деградацию ECM. Все эти процессы приводят к потере целостности, эластичности и образованию морщин.

Экзосомы, секретируемые клетками дермальных фибробластов человека, облученными UVB человеческими дермальными фибробластами (UVB-HDF), связаны с фотостарением кожи. Анализ профиля экспрессии микроРНК показал количество дисрегулируемых микроРНК во внеклеточных везикулах (ВВ), полученных из HDF, облученных UVB. При UVB-облучении экспрессия миРНК-22-5p значительно увеличивалась в клетках HDF и производных от них EV и могла передаваться в другие клетки HDF.

Дальнейший анализ показал, что активация микроРНК-22-5p способствует фотостарению путем воздействия на фактор дифференцировки роста-11 (GDF11) – белок, который защищает клетки HDF от фотостарения. В другом исследовании экзосомы, полученные в результате трехмерной (3D) агрегации клеток HDF или сфероидов, индуцировали синтез коллагена и уменьшали воспаление в модели фотостареющей кожи мышей. Была выдвинута гипотеза, что уровень экспрессии миР-133а и миР-223 повышен, а уровень экспрессии миР-196а снижен в экзосоме, полученной из культивированных 3D-сфероидов HDF, что может ингибировать экспрессию ММП, усиливать восстановление и замену коллагена, активировать сигнальный путь TGF-β. Таким образом, 3D HDF-XO можно использовать в качестве эффективного подхода для предотвращения фотостарения кожи [3].

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC). Представляют собой модельную клеточную линию для изучения эндотелиальных клеток и могут быть получены из пуповины.

Недавно Эллистасари и др. провели исследование in vitro, чтобы изучить влияние экзосом, полученных из клеток HUVEC, на ослабление фотостарения кожи. Они заметили, что Exo-HUVEC может заметно увеличивать пролиферацию клеток и синтез коллагена в фибробластах, облученных UVB. Более того, Exo-HUVEC может снижать экспрессию MMP, что приводит к ингибированию деградации коллагена в модели фотостареющей клеточной линии. Этот источник экзосом потенциально эффективен для предотвращения и лечения фотостарения кожи [3].

Интересно, что природные экзосомы, происходящие из растений или других организмов, содержат больше биоактивных молекул, чем экзосомы, полученные из клеток животных. В исследовании Han et al. было показано, что экзосомоподобные нановезикулы, полученные из лекарственного гриба Phellinus linteus (PL), обладают антивозрастным и противораковым действием.

Нановезикулы, подобные экзосомам грибов (FELNV), могут защитить кожу от фотостарения, вызванного UV-излучением. Было показано, что ЭВ грибов обогащены различными микроРНК, включая миР-СМ1-5, и среди них мИР-СМ1, который может защищать клетки НаСаТ от повреждений, вызванных UV-излучением. МиР-СМ1 оказывает защитный эффект за счет снижения маркеров, связанных со старением, таких как SA-ß-Gal, уровень АФК, экспрессия ММР1 и COL1A2. Міса/2 был известен как прямая мишень миР-СМ1, участвующая в регуляции возрастных процессов [3].

Влияние экзосом на клетки эпидермиса

Основным компонентом эпидермиса являются кератиноциты, которые составляют около 95%. Было обнаружено, что экзосомы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека (hucMSC-Exos), богатых белком 14-3-3ζ, ингибируют воспаление и снижают окислительный стресс. Кроме того, hucMSC-Exos защищают кератиноциты от вызванного нагреванием апоптоза, активируя АКТ (сигнальный путь с участием протеинкиназы В), и способствуют их пролиферации и миграции, подав-ляя ядерную транслокацию апоптоза.

Аналогично экзосомы стволовых клеток жировой ткани (ADSC-Exos) способствуют пролиферации и миграции клеток. Экзосомы из ADSC, предварительно обработанных гипоксией, ослабляют повреждение кожи, вызванное UV-излучением. Исследование показало, что экзосомы, выделенные из МСК, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), могут способствовать росту дермальных фибробластов человека (HDF), поддерживая пролиферацию и выживаемость клеток кожи [4].

Влияние экзосом на меланин

Исследования показали, что кератиноциты связываются с меланоцитами через экзосомы, которые несут микроРНК для модуляции пигментации. На функцию экзосом, происходящих из кератиноцитов, влияет фототип и модулирует UVB. Связанный с микрофтальмией транскрипционный фактор (MITF) является основным фактором транскрипции в меланогенезе, инициируя транскрипцию генов, кодирующих тирозиназу (TYR), TYRP-1 и TYRP-2.

Было продемонстрировано, что miR330-5p, полученная из экзосом кератиноцитов, уменьшает пигментацию меланоцитов. Недавние исследования подтвердили, что экзосомы, полученные из кератиноцитов человека, оказывают количественное влияние на активацию меланоцитов человека даже в отсутствие воздействия UVB [4].

Экзосомы молока богаты миР7, -10, -21, -26 и -143, которые среди прочих оказывают специфическое влияние на пигментацию. Например, миР-21 нацелена на SOX5 и ингибирует меланогенез в меланоцитах, облученных UV, тогда как миР-143 снижает выработку меланина за счет подавления экспрессии TGF-β-активируемой киназы-1 (TAK1). Кроме того, везикулы Lactobacillus plantarum (LpEV) подавляют пигментацию, вызванную старением кожи у женщин старше пятидесяти лет, хотя механизм этого не ясен [4].

Влияние экзосом на фибробласты

Было показано, что мезенхимальные стволовые клетки способствуют пролиферации, миграции и секреции коллагена фибробластов посредством паракринных механизмов. ADSC-Exos содержал различные цитокины, такие как IL-1, -2, -6, -8 и -13, а также EGF, FGF, PDGF-BB и IGFBP, которые способствуют рекрутированию и пролиферации дермальных фибробластов. Известно, что TNF-α, VEGF, TGF-β и TIMPs регулируют секрецию белка ЕСМ в дермальных фибробластах.

МСК пуповинной крови (UCB-MSC) могут усиливать заживление ран путем ингибирования рецептора TGF-b через miR21-5p и miR125b-5p. EPSC-Exos, богатые miR16, miR425-5p и miR142-3p, могут усиливать регенерацию придатков кожи, нервов и сосудов, одновременно улучшая распределение коллагена за счет ингибирования активности TGF‑β1 и его нижестоящих генов [4]. Кроме того, сообщалось, что MSC-Exos человека индуцируют пролиферацию и миграцию фибробластов in vitro у пациентов с диабетическими ранами.

Было обнаружено, что экзосомы стволовых клеток, полученные из жировой ткани, эффективно ингибируют избыточную генерацию АФК и SA-β-Gal, индуцированную стареющими HDF во время размножения in vitro, что указывает на их потенциал для омоложения этих клеток. Экзосомы, сверхэкспрессирующие ADSC MiR-1246, заметно увеличивают секрецию проколлагена I типа путем активации пути TGF-β/Smad [4].

Влияние экзосом на матриксные металлопротеиназы

Матриксные металлопротеиназы (ММП)

представляют собой ферменты с пептидной цепью, обнаруженные в живых организмах, которые связывают ионы металлов в их активных центрах. В коже человека при UV-облучении, ДСТ и старении значительно повышают экспрессию некоторых ММП, включая ММП-1, ММП-2, ММП-9 и ММП-3, которые способствуют деградации коллагена и эластина.

Количественный анализ RT-PCR и ELISA показал, что ADSC-Exos может снижать экспрессию MMP, индуцированную UVB, и восстанавливать коллаген, эластин, тканевый ингибитор матриксных металлопротеиназ-1 (TIMP-1) и трансформирующий фактор роста бета-1 (TGF-β1).

ADSC-Exos активирует путь ERK/MAPK, что приводит к увеличению MMP-3. Экспрессия и более высокое соотношение MMP-3 к TIMP-1 способствуют ремоделированию внеклеточного матрикса.

Предварительная обработка iPSC-Exos ингибирует индуцированную UVB активацию MMP-1 и MMP-3 и подавляет экспрессию мРНК коллагена I типа. Аналогичным образом, TB-Exos снижают экспрессию MMP и увеличивают экспрессию генов коллагена, эластина и фибронектина в фибробластах дермы человека (HNDF) [4].

Влияние экзосом на активные формы кислорода

Активные формы кислорода (АФК) являются побочными продуктами клеточного метаболизма; примеры включают перекись водорода, супероксидные анионы, гидроксильные радикалы и др.

Высокие концентрации АФК приводят к окислительному стрессовому повреждению ДНК, белков, липидов (связаны с солнечными ожогами), а, кроме того, к канцерогенезу, воспалительным заболеваниям и старению. АФК, генерируемые UVB-облучением, активируют транскрипционные факторы, такие как AP-1, в фибробластах дермы, что способствует выработке ММП и ингибирует секрецию коллагена, нарушая функцию TGF-β. Повышенные уровни АФК способствуют перекисному окислению липидов и окислению белков, что отражается такими биомаркерами, как малоновый диальдегид (МДА) и карбонил белка (ПК) соответственно.

ADSC-Exos активируют супероксиддисмутазу (СОД) и снижают уровень МДА, противодействуя окислительному процессу кожи, вызванному галактозой.

Никотинамидадениндинуклеотидфосфатоксидаза (NOX) является ключевой ферментной системой производства АФК in vivo. Исследования показали, что ADSC-Exos также ингибирует экспрессию ферментов, производящих АФК, таких как NOX1 и NOX2, что приводит к снижению производства АФК [4].

Глутатионпероксидаза-1 (GPX1) является основной ферментной системой, поглощающей АФК. hucMSC-Exos обеспечивает антиоксидантную гепатозащиту против CCl4 и H2O2, доставляя GPX1 для снижения уровня АФК и ингибирования апоптоза, вызванного окислительным стрессом. Этот эффект опосредован усилением регуляции ERK1/2 и Bcl-2 и подавлением пути IKKB/NF-kB/casp-9/-3. Экзосомы молока повышают устойчивость к окислительному стрессу за счет снижения уровня АФК, вызванного UVС-излучением, через путь GSH, тем самым сохраняя способность индуцировать пролиферацию поврежденных клеток [4].

Таким образом, MSC-Exos подавляют воспалительные реакции, индуцируя поляризацию макрофагов M2 и дифференцировку Treg. В моделях на мышах эти экзосомы увеличивают количество нейтрофилов, одновременно уменьшая количество циркулирующих эозинофилов, инфильтрирующих кожу тучных клеток и клеток, экспрессирующих CD86 и CD206. Они также подавляют уровни мРНК IL-4, IL-23, IL-31 и TNF-α [4].

Методы получения экзосом
1. Выделение стволовых клеток.

2. Культивирование стволовых клеток.

3. Выделение экзосом из фильтрата:
а) хроматография с определением размера. Этот метод разделяет частицы в зависимости от размера;
б) ультрацентрифужное разделение. Оно основано на размере и седиментационных свойствах или плотности в градиентах сахарозы;
в) методы, основанные на микрофлюидике. Они основаны на физических свойствах (размер и плотность) или химических свойствах (связывание с поверхностными антигенами экзосом);
г) иммуноаффинные методы. Захват экзосом осуществляется на основе их специфического связывания с антителами или магнитными наночастицами;
д) ультрафильтрация. Частицы центрифугируются через фильтр и разделяются в зависимости от размера пор фильтра.

4. Лиофилизация.

Методы доставки экзосом в кожу

При неинвазивном лечении экзосомы включаются в кремы, сыворотки, масла и маски для местного применения. Экзосомы также можно добавлять в биоактивные полимерные материалы, такие как гидрогель, что обеспечивает замедленное высвобождение, поддержание pH и усиление регенеративного потенциала.

Местные инъекции – это инвазивный тип лечения, при котором антивозрастные молекулы вводятся во внутренний слой кожи для усиления терапевтического эффекта и преодоления кожного барьера. Было продемонстрировано, что субдермальная инъекция ADSC эффективна в снижении антифотогенного эффекта за счет ремоделирования ЕСМ и неоэластогенеза. Местные инъекции обеспечивают более эффективное лечение кожи по сравнению с продуктами для местного применения из-за пропуска кожного барьера.

Системное лечение – еще один метод, ранее использовавшийся для доставки экзосом посредством внутривенной инъекции. Было показано, что местное применение экзосом в сочетании с внутривенными инъекциями эффективно ускоряет заживление ран недиабетических пациентов [3, 5].

Несмотря на огромные преимущества экзосом, их регуляторные аспекты остаются предметом дискуссий. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) еще официально не классифицировало экзосомы для косметики; поэтому пока неизвестно, какой тип регулирования следует ввести.

В ЕС экзосомы для косметического использования может регулироваться Европейской комиссией, которая вправе включать ограничения на производство, маркировку и рекламу. Поскольку экзосомы являются относительно новой технологией, дальнейшие исследования и обсуждения необходимы для понимания регуляторных последствий их использования [6].